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實時熒光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,熒光定量)分類以及實驗步驟介紹

   日期:2019-08-19     來源:威斯騰生物技術服務中心    瀏覽:4434    

實時熒光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,熒光定量技術(Real-time quantitative PCR),是指在(QPCR,熒光定量)反應體系中加入熒光基因,利用熒光信號積累實時監測整個(QPCR,熒光定量)PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR技術于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出,由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,實時熒光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,熒光定量)它具有特異性更強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,已成為國際公認的核酸分子定量的標準方法,目前(Real-time PCR,QPCR,熒光定量)在基因表達研究和臨床疾病檢測等領域已得到廣泛應用(如轉基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達、基因分型)。本公司用Sybrgreen法或者Taqman法Real-time PCR,QPCR,熒光定量)對DNA/RNA 進行實時熒光定量PCR(Real-time PCR) 的定量測定或型的鑒定。
實時熒光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,熒光定量分類:

☆TaqMan熒光探針Real-time PCR,QPCR,熒光定量
    PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5‘-3‘外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

☆SYBR Green熒光染料法:Real-time PCR|QPCR
    SYBR Green是一種DNA結合染料,能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態下,它不發出熒光,但一旦結合到雙鏈DNA中以后,便可以發出熒光。Real-time PCR|QPCR實驗中它的最大優點就是可以與任意引物、模板相配合,用于任意反應體系中。從經濟角度考慮,它也比其它的探針的Real-time PCR|QPCR價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結合,所以一旦反應體系中出現非特異擴增,那它就會影響到定量結果的可靠性與重復性。要避免這種不利因素,可以通過選擇良好的引物并優化反應條件以消除非特異性影響。


客戶提供
(1)Real-time PCR|QPCR基因信息
(2)Real-time PCR|QPCR實驗前盡可能新鮮和足夠量的組織(≧100mg)、細胞樣品(10  )或血清,或直接提供純化好的總RAN(≧1ug)
  歷經10多年的發展,實時熒光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,熒光定量)已經由最初的簡單定性發展到現在的Real-time PCR|QPCR,可以做到PCR每循環一次就收集一個數據,建立實時擴增曲線,準確地確定CT值,從而根據CT值確定起始DNA拷貝數,做到了真正意義上的DNA定量。技術的成熟,為其廣泛的應用奠定了基礎。
威斯騰生物|實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR|服務內容
(1)根據Real-time PCR|QPCR目的基因設計引物及引物合成
(2)RNA抽提+逆轉錄
(3)RNA定量及質量分析
(4)使用熒光染料SYBR Green法進行Real-time PCR|QPCR(重復三次)
(5)數據處理
實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR的原始數據。擴增產物有良好的熔解曲線,可靠的重復性
實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR 標準實驗流程報告
實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR實驗結果檢測報告。

 

●主要實驗步驟如下: 

實時熒光定量PCR(Real-time PCR)是由三個步驟組成:
1.反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA;
2.擴增:用PCR的方法擴增cDNA;
3.檢測:實時檢測和定量擴增的產物.

實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR中的一些術語

1 CT值:熒光信號有統計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環次數,或者說是從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數。

2 閾值:閾值的默認設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。

3 CT值與起始模板的量成線性關系。

 
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