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高通量實驗室設計與建設

   日期:2019-09-05     來源:現代實驗室裝備網    瀏覽:915    
核心提示:NGS實驗室又叫高通量測序檢測實驗室。
 No.1

高通量測序(NGS)實驗室簡介

 

1.1NGS實驗室又叫高通量測序檢測實驗室。NGS是下一代測序技術( Next Generation Sequencing)即高通量測序技術的簡稱。高通量測序技術是對傳統Sanger測序(稱為一代測序技術)革命性的改變, 可同時對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定,同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能, 也稱為深度測序(Deep sequencing)。


1.2由于NGS技術對所檢測的核酸模板進行大量擴增,容易出現實驗室污染導致檢測結果準確性下降;另外NGS技術要求高、影響因素多,實驗過程處理不當易導致檢測結果準確性下降或檢測失敗。因此臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收和規范化管理是NGS技術本身需要,也是在臨床上順利應用該技術前提。

No.2

NGS實驗室臨床應用的基本條件

 

2.1必須擁有符合臨檢中心相關規定的標準NGS實驗室。


2.2檢測設備必須符合標準NGS實驗室設置要求:高通量測序儀及配套服務器;高通量測序檢測試劑盒;通用電腦;自動分析軟件,實驗室樣本信息管理系統等。


2.3檢測人員必須通過專門的技能培訓,并獲得省級以上衛生計生行政部門頒發的臨床基因擴增檢驗技術上崗證書。NGS實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序(SOP)、建立系列質量管理文件等,確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求,確保檢測結果準確、確保實驗室衛生安全,確保實驗室長期穩定運行。


2.4NGS臨床應用必須在無菌無塵環境下進行操作。

No.3

NGS實驗室建設基本要求

 

3.1主體結構主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽角均采用鋁合金50內圓角鋁,從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結構牢固,線條簡明,美觀大方,密封性好。


3.2標準的各區分隔和氣壓調節將檢測過程分成試劑準備、樣本制備、PCR擴增和高通量測序四個獨立的實驗區。整個區域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區設置有緩沖區,同時各區通過氣壓調節,使整個檢測實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環境的污染。可打開緩沖區和 PCR 擴增區的排風扇往外排氣,在實驗區的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調的回風口,空氣通過回風口向室內換氣。


3.3消毒在每個實驗區和緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈,供消毒用。在各區還設置移動紫外線燈,對實驗桌進行局部消毒。


3.4機械連鎖不銹鋼傳遞窗試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼(不建議使用電子連鎖方式)傳遞窗傳遞,保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染(人物分流)。


3.5地面地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面,整體性好。便于進行清掃,耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面,或大塊的瓷磚(至少800mm×800mm)接縫需要小于2mm。


3.6照明燈具要選用凈化燈具,能達到便于清洗、不積塵的特點。


3.7平面布局NGS實驗室應根據自己的檢驗項目、所采用的檢測技術平臺和工作量來決定分區的多少及各區域的空間大小,至少具體需要多少個區,同樣是“個體化”的,以“工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時”作為基本原則。

No.4

各項目實驗室建設標準

 

產前篩查與產前診斷(全基因組低拷貝測序技術)

1.實驗室平面圖


▲圖1:產前篩查與診斷實驗室平面圖

2. 技術流程圖


▲圖2:產前篩查與診斷技術流程圖

3. 技術參數分區

壓力 溫度 相對 濕度照明專用

走廊0Pa

緩沖區+5Pa

試劑準備室+15Pa 20-25℃ 40%~60% 主實驗室≥300LX,其余房間200~300LX

標本與文庫制備區 +10Pa

文庫擴增與檢測區 -5Pa

測序區 -10Pa


4.分區功能

4.1試劑準備室

主要功能:在NGS過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。


4.2標本與文庫制備區

主要功能:血液處理、血漿制備、DNA提取、DNA片段化、DNA樣品的純化、DNA濃度檢測、末端修復、接頭連接、構建樣本的測序文庫。


4.3文庫擴增與檢測區

主要功能:文庫構建后的PCR擴增與純化、文庫濃度檢測、文庫的混合及混合后的質檢分析。


4.4測序區

主要功能:測序模板制備(乳液PCR與磁珠富集回收)、上機測序、數據分析、報告審核及發放。

5.儀器配置

5.1試劑準備室

主要儀器設備:加樣器、冰箱、分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈和超凈工作臺等。


5.2標本與文庫制備區

主要儀器設備:冷凍離心機、微量臺式離心機、掌上三管離心機、渦旋震蕩器、垂直混合儀、移液器、可移動紫外燈、生物安全柜、冰箱、托盤天平、Qubit 2.0核酸定量儀、電腦(可連接互聯網)、條形碼打印機、普通打印機、掃描槍、磁力架等。


5.3文庫擴增與檢測區

主要儀器設備:PCR儀、QPCR儀、Qubit2.0核酸定量儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、UPS、冰箱、移液器、磁力架等。


5.4測序區

主要儀器設備:高通量測序儀、PC電腦、打印機、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺、可移動紫外燈、磁力架、PCR儀等。


n胚胎植入前遺傳學診斷(全基因組低拷貝測序)

1. 實驗室平面圖


▲圖3:PGD實驗室平面圖

2. 技術流程圖


▲圖4:PGD技術流程圖

3. 技術參數

分區 壓力 溫度 相對 濕度照明

專用走廊 0Pa

緩沖區 +5Pa

試劑準備室 +15PaWGA

制備室 +10pa 20-25℃ 40%~60% 主實驗室≥300LX,其余房間200~300LX

擴增一區 -5pa

標本檢測區 -10Pa

測序區 -15Pa

電泳區 0Pa

4. 分區功能

4.1試劑準備室

主要功能:在NGS過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。


4.2WGA制備區

主要功能:基因組DNA釋放、全基因組DNA擴增。


4.3電泳

主要功能: DNA電泳檢測及結果反饋、DNA打斷等


4.4擴增一區

主要功能:DNA片段的末端修復與純化、接頭連接與純化、文庫混合、缺口平移。


4.5文庫檢測區

主要功能:文庫濃度質檢分析。


4.6測序區

主要功能:測序模板制備(乳液PCR與磁珠富集回收)、上機測序、數據分析、報告審核及發放。

5.儀器配置

5.1試劑準備區

主要儀器設備:冰箱、分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈和超凈工作臺等。


5.2電泳區

主要儀器設備:電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。


5.3WGA制備區

主要儀器設備:PCR儀、超凈工作臺、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。


5.4擴增一區

主要儀器設備:PCR儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、UPS、移液器、磁力架等。


5.5文庫檢測區

主要儀器設備: QPCR儀、Qubit2.0核酸定量儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、冰箱、移液器等。


5.6測序區

主要儀器設備:高通量測序儀、PC電腦、打印機、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺、可移動紫外燈、磁力架、PCR儀等。


n遺傳病診斷+腫瘤診斷與治療(雜交捕獲測序技術+Sanger測序驗證)

1. 實驗室平面圖


▲圖5:腫瘤診斷實驗室平面圖

2. 技術流程圖


▲圖6:腫瘤診斷技術流程圖


▲圖7:一代測序實驗流程圖

3. 技術參數

分區 壓力 溫度 相對濕度 照明

潔凈走廊 0Pa

緩沖區 +5Pa

試劑準備室 +15Pa

標本與文庫制備區 +10Pa

DNA打斷區 +10Pa 20-25℃ 40%~60% 主實驗室≥300LX,其余房間200~300LX

雜交捕獲區(擴增一區) -5Pa

文庫擴增區(擴增二區) -10Pa

文庫檢測區 -10Pa

測序區 -15Pa

電泳區 0 Pa

4. 分區功能

4.1試劑準備區

主要功能:在NGS過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。


4.2標本與文庫制備區

主要功能:樣本接收、樣本前處理、全基因組DNA提取以及各種樣本DNA或者RNA的提取、DNA片段化、DNA純化、DNA濃度測定、DNA片段的末端修復與純化、接頭連接與純化。


4.3DNA打斷區

主要功能: DNA打斷(片段化)。


4.4電泳區

主要功能:片段化DNA電泳檢測及結果反饋。


4.5雜交捕獲區(擴增一區)

主要功能:目的DNA片段的雜交捕獲與純化,Sanger測序目的片段擴增與純化、Sanger測序PCR前準備。


4.6文庫擴增區(擴增二區)

主要功能:雜交捕獲后擴增與純化、文庫濃度質檢分析、及Sanger測序的PCR擴增反應與純化。


4.7測序區

主要功能:測序模板制備(乳液PCR與磁珠富集回收)、上機測序、及Sanger測序。


5.儀器配置

5.1試劑準備區

主要儀器設備:加樣器、冰箱、分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈和超凈工作臺等。


5.2標本與文庫制備區

主要儀器設備:微量臺式離心機、掌上三管離心機、恒溫金屬浴、移液器、可移動紫外燈、生物安全柜、冰箱、托盤天平、Qubit 2.0核酸定量儀、PCR儀、電腦(可連接互聯網)、條形碼打印機、普通打印機、掃描槍等。


5.3DNA打斷區

主要儀器設備:Covaris S220超聲波打斷儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。


5.4電泳區

主要儀器設備:電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。


5.5雜交捕獲區(擴增一區)

主要儀器設備:PCR儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器等。


5.6文庫擴增區(擴增二區)

主要儀器設備:PCR儀、Qubit 2.0核酸定量儀、微量臺式離心機、掌上三管離心機、渦旋震蕩器、移液器、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、磁力架等。


5.7測序區

主要儀器設備:高通量測序儀、Sanger測序儀、PC電腦、打印機、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺、可移動紫外燈、磁力架、PCR儀等。

 
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